锐翌基因协医院在柳叶刀子刊《EbioMedicine》发表了《GutmicrobiotafromcolorectalcancerpatientsenhancestheprogressionofintestinaladenomainApcmin/+mice》，其中微生物16S和转录组测序由锐翌基因完成。

导读

越来越多的证据表明肠道菌群失调与结直肠癌（CRC）之间存在密切关系，90%以上的CRC由腺瘤发展而来。腺瘤性息肉病基因（adenomatouspolyposiscoli,Apc）突变是腺瘤形成的早期事件，Apc基因第号密码子发生等位突变可自发形成肠道多发腺瘤，伴或不伴低级别上皮内瘤变。因此Apcmin/+小鼠是研究肠道肿瘤较为理想的动物模型。该研究对抗生素处理之后的Apcmin/+小鼠进行CRC患者或健康人的粪菌移植，结果发现CRC患者肠道菌群可破坏小鼠肠道物理、化学和免疫屏障，诱发慢性炎症，促进Apcmin/+小鼠肠道腺瘤癌变。其机制在于肠道菌群可改变肠道组织基因表达谱，激活参与肿瘤形成的Wnt信号通路。该研究提出了一种肠道微生物群对抗CRC的新策略，为未来的临床治疗策略提供理论依据。

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文献ID

题目：GutmicrobiotafromcolorectalcancerpatientsenhancestheprogressionofintestinaladenomainApcmin/+mice

译名：结直肠癌患者肠道菌群可促进Apcmin/+小鼠肠腺瘤的发生发展

期刊：EbioMedicineIF：6.68

发表时间：年10月5日

第一作者：李璐、李晓飞和仲威龙

通讯作者：曹海龙、姜葵和王邦茂教授

通讯单位：医院

材料与方法

研究思路

实验分组：C57BL/6J小鼠分为两组：一组灌服健康对照粪便样本（FMT-CH），另一组灌服CRC患者粪便样本（FMT-CC）；Apcmin/+小鼠分三组：PBS组（灌服PBS），FMT-AH（灌服健康对照粪便样本），FMT-AC（灌服CRC患者粪便样本）。

高通量测序及代谢检测手段

16SrDNA测序：IlluminaPE

转录组测序：IlluminaPE

短链脂肪酸检测：GC-MS

研究成果

1、粪菌移植实验

在8周的实验周期里，各组小鼠体重缓慢增长（图1b），所有小鼠耐受良好，全部存活。在第八周，PBS组小鼠未出现明显的肉眼血便，FMT-AH组2只小鼠和FMT-AC组6只小鼠出现稀便和血便（P0.05）。此外，与FMT-AH组相比，FMT-AC组肝脏和脾脏的重量相似（图1c）。

图1结直肠癌患者的肠道菌群增加了Apcmin/+小鼠的肠道肿瘤

2、CRC患者肠道菌群加重了肠腺瘤的进展

第8周时，评估FMT对肠腺瘤的影响；结果发现，FMT-CH组和FMT-CC组均未发现肿瘤；与PBS组和FMT-AH组相比，FMT-AC组小鼠的腺瘤总数增加（图1d）。相对于FMT-AH组，FMT-AC组腺瘤的数量增加主要在小肠的近端和中间，而小肠远端无明显差异（图1e）。

根据最大直径1mm、1-2mm、2mm分别计算小鼠肠腺瘤数量。FMT-AC组中直径为1-2mm和2mm的腺瘤总数显著高于FMT-AH组。FMT-AC组小肠中，直径为1-2mm的腺瘤数量显著增加（图1f）。

图2CRC患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠肠腺瘤的发展进程

在PBS组和FMT-AH组中，观察到少量散在的小息肉，而在FMT-AC组中观察到更多的肿瘤，特别是在结肠观察到突出肠腔的大腺瘤（图2a）；且FMT-AC组中共有7只小鼠出现高级别瘤变，而FMT-AH中只有1只小鼠表现为高级别瘤变（图2b）。

为了探讨CRC肠道菌群对肿瘤细胞的影响，我们检测了小鼠肠道肿瘤组织的细胞增殖和凋亡。结果发现，与FMT-AH组相比，FMT-AC组的Ki-67阳性细胞显著增加，凋亡细胞数量减少（图2c），这表明了CRC患者的肠道菌群可促进肠道肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡。

3、CRC患者肠道菌群损害肠屏障功能

CRC患者肠道菌群FMT后，紧密连接蛋白（包括ZO-1、Occludin和Claudin3）的mRNA表达量下降（图3a）。结肠组织PAS染色显示，FMT-AC组中每个隐窝的杯状细胞平均数量较低。免疫组化显示，FMT-AC组的溶菌酶阳性细胞明显降低（图3b）。CRC患者肠道菌群会下调Muc2（黏液层的主要成分）、防御素（Cryptdin）和再生胰岛衍生蛋白3γ（Reg3γ）的mRNA表达（图3c），sIgA的表达也降低（图3d）；这些结果表明CRC患者肠道菌群会引起Apcmin/+小鼠肠道分泌功能受损，破坏其杯状细胞和Paneth细胞，并诱发慢性低度炎症。

注：Cryptdin和Reg3γ是Paneth细胞分泌的抗菌肽，可保护肠道免受肠道致病菌的感染；

肠道分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是胃肠道黏膜上的主要免疫效应分子，是抵抗病原性黏膜黏附和定植的重要防御系。

图3CRC患者肠道菌群会破坏Apcmin/+小鼠肠屏障功能并诱导慢性低度炎症

4、CRC患者肠道菌群诱发慢性低度炎症

慢性炎症是公认的CRC危险因素。本研究各组小鼠小肠组织HE染色均未见明显炎性细胞浸润。而实时荧光定量PCR显示FMT-AC组中NLRP3、IL-1β和TNF-α的表达量增加（图3a）。这表明来自CRC患者肠道菌群诱导Apcmin/+小鼠发生了慢性低度炎症。

5、FMT后肠肿瘤组织的差异表达基因

利用转录组测序分析揭示FMT后FMT-AH和FMT-AC组小鼠的差异表达基因；根据各样品的FPKM进行层次聚类分析，结果发现FMT-AH和FMT-AC组小鼠各自聚集（图4a)，差异分析发现FMT-AC组小鼠中有个上调基因、50个下调基因（图4b）。对这些基因进行GO功能注释发现，上调基因主要富集在Wnt信号通路、脂代谢和T-helper17型免疫应答。Wnt信号通路的激活、脂质代谢异常和免疫系统在腺瘤的进展中起关键作用（图4c和d）。这些通路的激活都与肿瘤进程有关。RNA-seq转录组研究有助于阐明与Wnt信号通路相关的基因通路，并为我们提供了进一步研究的线索。

图4肠肿瘤组织中差异表达的基因

6、CRC患者肠道菌群激活Wnt信号通路

β-catenin的表达在FMT-AH组主要位于细胞膜上，而CRC患者肠道菌群改变了Apcmin/+小鼠肠道细胞中β-catenin的分布，促使其从细胞膜向细胞质和细胞核转移（图5a）；且与FMT-AH组相比，FMT-AC组中cyclinD1阳性细胞的百分比显著增加。尽管总β-catenin蛋白表达没有差异，但FMT-AC组中活性β-catenin、cyclinD1和c-myc的蛋白水平显著上升（图5b）。综上所述，CRC患者的肠道菌群促进了Wnt信号通路的激活。

图5结直肠癌患者肠道菌群激活Wnt信号通路

7、FMT后肠道菌群的转移

检测不同供体粪菌上清液的成分，结果发现与健康对照相比，CRC患者粪菌上清液中roseburia和梭菌属的相对丰度降低，而Akkermansia的相对丰度上升（图6a）。最后一次FMT后，采集新鲜小鼠粪便进行16S检测，发现FMT-AH和FMT-AC组小鼠肠道微生物在属水平上存在差异（图6b），但α多样性结果显示两组无显著差异（图6c和d），而β多样性的NMDS和anosim结果显示两组小鼠的微生物组成存在显著差异，且组间差异大于组内差异（图6e和f）。

图6肠腺瘤进展过程中的肠道菌群失调会发生转移

FMT-AC组中，Akkermansia、Pseudoflavonifractor、普氏菌属、大肠埃希氏菌和螺杆菌属相对丰度显著升高，而产丁酸盐的细菌，如瘤胃球菌属、Roseburia和梭菌属的相对丰度显著降低（图7a和b）。微生物间互作关系表明，Roseburia和优杆菌属存在显著负相关，Flavonifractor和双歧杆菌属也存在显著负相关；Anaerotruncus和Flavonifractor呈显著正相关，Akkermansia和Phascolarctobacterium呈显著正相关（图7c）。

图7肠道微生物群移植后的变化

进一步研究差异表达基因与物种的相关性，发现FMT-AH组小鼠肠道中富集Roseburia、Anaerotruncus、Flavonifractor和Eisenbergiella，而FMT-AC组小鼠肠道中富集Eubacterium、Rikenella、Alistipes、Helicobacter和双歧杆菌属；值得注意的是Eubacterium和Roseburia与上调的差异基因具有显著相关性；Eubacterium与Fzd10、Cpt1c基因表达呈显著负相关，Roseburia与Apod、Scd3、Tns4、Tdgf1等基因的表达呈显著正相关（图7d），而其他富集的物种与上调的差异基因没有显著相关性。

8、CRC患者肠道菌群降低了小鼠盲肠组SCFAs的浓度

肠道微生物衍生的短链脂肪酸已被证实可通过保护上皮屏障的完整性和调节T细胞分化来维持肠道内稳态。上述小鼠肠道微生物分析显示，FMT-AC组小鼠的产丁酸盐相关的物种相对丰度降低；因此我们检测了盲肠中乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的含量，结果发现与FMT-AH组相比，FMT-AC组盲肠中乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的含量显著降低（图7e）。

研究结论

图8CRC患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠肠腺瘤的发生进程机制

1.CRC患者肠道菌群促进Apcmin/+小鼠肠道肿瘤形成，促进癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡；

2.CRC患者肠道菌群会破坏Apcmin/+小鼠肠道物理、化学和免疫屏障，诱发慢性炎症;

3.粪菌移植后，肠道肿瘤组织基因表达谱发生改变，参与肿瘤形成的Wnt信号通路被激活；且Apcmin/+小鼠粪便中致病菌丰度增加，产短链脂肪酸（SCFA）的细菌丰度减少，SCFA含量减少。

亮点

本研究揭示了肠道菌群在肠腺瘤发生发展中的重要作用，主要表现在移植CRC患者肠道菌群会导致Apcmin/+小鼠肠道中致病菌丰度增加而产生短链脂肪酸物种丰度降低，影响小鼠肠屏障功能并诱导慢性低度炎症，促进Wnt代谢通路的活化和肿瘤细胞增殖等。

锐翌基因科服产品

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供稿：卢彦姣

编辑：鲁淑妮

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